Evaluación toxicológica de aleaciones metálicas nanocristalinas con potenciales aplicaciones en el campo aeronáutico

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 1523 (2022) Citar este artículo

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El desarrollo de nuevas aleaciones candidatas con características destacadas para su uso en el ámbito aeronáutico es una de las principales prioridades del sector. En este contexto, las aleaciones nanocristalinas (nc) se consideran materiales relevantes debido a sus características especiales, como sus excepcionales propiedades físicas y mecánicas. Sin embargo, otro punto importante que debe tenerse en cuenta con las aleaciones recientemente desarrolladas es el posible impacto toxicológico que estos materiales pueden tener en los seres humanos y otros organismos vivos. El objetivo de este trabajo fue realizar una evaluación toxicológica preliminar de tres aleaciones metálicas nc (WCu, WAl y TiAl) en forma de polvo producidas por aleación mecánica, aplicando diferentes ensayos in vitro, incluyendo una mezcla de polvos de W-Cu con tamaño de grano estándar. en los experimentos para establecer comparaciones. Los efectos de la exposición directa a suspensiones de polvo y/o a sus lixiviados derivados se analizaron en tres organismos modelo representativos de la exposición humana y ambiental (la línea celular epitelial basal alveolar humana adenocarcinómica A549, la levadura Saccharomyces cerevisiae y la bacteria Gram negativa Vibrio fischeri ). En conjunto, los resultados obtenidos proporcionan nuevos conocimientos sobre los posibles efectos nocivos de las aleaciones de nc seleccionadas, lo que demuestra que, desde una perspectiva toxicológica, nc TiAl es el candidato más seguro en los organismos modelo y las condiciones probadas.

El concepto de materiales nanocristalinos (nc), que fue introducido por primera vez por Gleiter1, en el caso concreto de las aleaciones, se refiere a un metal que presenta un tamaño de grano medio en la escala nanométrica, siendo este valor inferior a 100 nm. Las extraordinarias propiedades mecánicas, químicas y físicas que presentan estos materiales han llamado la atención de la comunidad científica y, por ello, los metales nc han sido objeto de intensa investigación interdisciplinar2,3,4,5,6. Entre las características destacadas que poseen estos materiales se pueden destacar sus excepcionales características catalíticas y térmicas, así como su gran resistencia, dureza y mayor resistencia al desgaste7, todas ellas dadas por sus específicas propiedades estructurales. Así, el uso de aleaciones NC podría representar un impacto significativo en aquellos sectores donde existe la necesidad de la aplicación de materiales con estas características especiales, como la industria aeroespacial o aeronáutica.

En los últimos años, y impulsado por la fuerte competencia que existe en el sector, el desarrollo de nuevos materiales para aplicaciones aeronáuticas se ha considerado una de las principales prioridades de este sector8. Por ello, se han realizado extensas investigaciones para abordar esta cuestión, poniendo el esfuerzo en la búsqueda de materiales que permitan reducir costes, al tiempo que proporcionen una mejora en su comportamiento ante duras condiciones (resistencia al desgaste y a la corrosión, tolerancia al daño…)9. 10,11. Por lo tanto, la selección de elementos para desarrollar una nueva aleación candidata es un paso crítico que debe considerarse cuidadosamente. En este contexto, la técnica de aleación mecánica, que permite combinar elementos difíciles o imposibles de fundir mediante otros procedimientos convencionales12, destaca como metodología relevante para la producción de nuevas aleaciones. Además, en el caso de los nanomateriales metálicos, se ha demostrado que la aleación amplía significativamente el rango de temperatura donde se inhibe el engrosamiento, que es uno de los efectos perjudiciales que estos materiales pueden presentar cuando están constantemente expuestos a altas temperaturas4,13,14. En este sentido, varias aleaciones metálicas NC han mostrado un comportamiento mejorado a altas temperaturas en comparación con sus homólogas de metal puro15,16.

Además de las características mecánicas y físicas excepcionales que deben tener las aleaciones recientemente desarrolladas para permitir su uso en las áreas de interés, se debe considerar su seguridad humana y ambiental. De hecho, la toxicidad de diferentes aleaciones metálicas relevantes ampliamente utilizadas en diferentes campos como el biomédico o militar (fabricación de dispositivos médicos, fabricación de municiones…)17,18 ya ha sido evaluada utilizando métodos tanto in vitro como in vivo19,20,21. 22. Sin embargo, con el auge de la industria de fabricación aditiva en los últimos años, el uso de polvos metálicos está actualmente mucho más extendido. Dado que los polvos metálicos pueden resultar más tóxicos que sus homólogos a granel23, se debe considerar de vital importancia proporcionar información sobre las posibles consecuencias asociadas a su manipulación y gestión, considerando también la posible lixiviación debido a su deterioro y degradación.

En este estudio, se evaluaron desde una perspectiva toxicológica tres aleaciones metálicas binarias de tipo nanograno producidas mediante aleación mecánica, con características prometedoras en términos de niveles de rendimiento en condiciones extremas y viabilidad de fabricación. Se seleccionaron las siguientes aleaciones binarias: una aleación metálica ligera, resistente al calor y de alta resistencia para aplicaciones aeronáuticas: TiAl; y dos aleaciones metálicas resistentes a la radiación para aplicaciones espaciales de protección contra la radiación: WAl y WCu. Por lo tanto, se analizó el impacto biológico de los polvos de aleación de nc WCu, WAl y TiAl realizando diferentes ensayos in vitro utilizando dos organismos modelo que fueron seleccionados como representantes de la exposición humana (línea celular A549) y ambiental (Saccharomyces cerevisiae). Además, se estudió la potencial toxicidad de los lixiviados de aleaciones producidos por estos materiales en la línea celular A549, así como en la bacteria bioluminiscente Vibrio fischeri. También se incluyó en los experimentos una mezcla de polvo de W-Cu de calidad comercial de tamaño de grano estándar (25% en peso de Cu). En conjunto, este trabajo proporciona información preliminar sobre la seguridad de las diferentes aleaciones NC, brindando datos valiosos para ayudar a determinar el candidato más apropiado considerando sus propiedades potencialmente peligrosas.

En el presente estudio se han seleccionado tres aleaciones binarias de nc para su evaluación toxicológica, debido a sus especiales características y potencial aplicación en la industria aeronáutica. Las propiedades de diferentes aleaciones nc WAl, incluida una W80Al20 como la estudiada en este trabajo, han sido descritas recientemente, mostrando que la adición de Al resultó en una mejora significativa de la resistencia al engrosamiento y la sinterabilidad con respecto al tungsteno comercial puro24. Respecto al nc WCu, también se investigaron recientemente las características de esta aleación25. W y Cu son sistemas metálicos inmiscibles que son aleables mediante la aplicación de aleación mecánica, combinando los excelentes atributos del W (altas características termomecánicas y de blindaje contra la radiación) con los del Cu (alta conductividad térmica y eléctrica)12,26. Finalmente, TiAl es una fase intermetálica donde Ti y Al están unidos por restricciones estequiométricas. Las aleaciones de Ti se aplican ampliamente para la fabricación de componentes estructurales para aeronaves, ya que presentan una resistencia excepcional y resistencia a la corrosión8.

La composición, estructura cristalina, tamaño de partícula y lixiviabilidad son factores que pueden influir en la toxicidad de los polvos de aleación, siendo SEM, XRD e ICP-MS muy útiles para evaluar estos parámetros. Por lo tanto, los polvos de aleaciones estudiados en este trabajo se caracterizaron aplicando las metodologías mencionadas. Primero, se calculó el tamaño promedio de los cristalitos de las tres aleaciones nc (ncWCu, WAl y TiAl) utilizando la ecuación de Scherrer. Esta fórmula, que es eficaz para cristalitos de tamaño nanométrico, se basa en los patrones XRD adquiridos en los polvos aleados mecánicamente (material suplementario, Figs. S1, S2, S3). El tamaño de grano promedio de cada muestra se representa en la Tabla 1, la cual muestra que las tres aleaciones nc estudiadas exhibieron valores similares.

SEM y SEM EDX se utilizaron respectivamente para visualizar y analizar la composición elemental de todos los polvos de aleación (% en peso), incluidos los de la muestra de WCu (sWCu) de tamaño de grano estándar. Dado que en la preparación de las muestras se utilizó cinta adhesiva de carbón, en todas ellas se detectaron bajos porcentajes de C (≤ 8%), así como bajos porcentajes de O, lo que son indicativos de un bajo grado de oxidación en la superficie. Además de estos elementos, en las muestras se detectaron niveles bajos de otros relacionados con los materiales de los medios de molienda aplicados, como Ni o Fe. Dado que esta muestra fue producida por la mezcla de los polvos de los 2 elementos, el sWCu, como se esperaba, demostró ser heterogéneo. Así, se detectaron diferentes partículas de W y Cu, y también se distinguieron mediante microscopía electrónica de barrido (Fig. 1). Respecto al ncWCu, los porcentajes de W y Cu detectados fueron 59,13% ± 1,99 y 26,37% ± 1,02 respectivamente. En el caso de las muestras de WAl y TiAl, los porcentajes de los diferentes elementos detectados fueron 89,18% ± 1,80 de W y 3,78% ± 0,43 de Al en el primero, y 77,18% ± 3,24 de Ti y 13,95% ± 2,23 de Al en el segundo. .

Morfología de los polvos metálicos. SWCu (A), (E); ncWCu (B), (F); WAl (C), (G) y TiAl (D), (H). Imágenes (A), (B), (C) y (D): Ampliación original × 100 (barra de escala = 100 μm); Imágenes (E), (F), (G) y (H): Ampliación original × 500 (barra de escala = 50 μm).

La morfología de las muestras seleccionadas se analizó y visualizó mediante SEM (Fig. 1). En todos los casos, se observó una variedad de partículas, con tamaños en la escala micrométrica, en su mayoría desde unas pocas hasta varias docenas de micrómetros. Los polvos de TiAl mostraron las partículas de mayor tamaño (Fig. 1D, H), mientras que las partículas de WAl mostraron la mayor heterogeneidad (Fig. 1C, G). En cuanto a su forma y morfología, se distinguieron partículas poligonales y redondas en todas las aleaciones NC. En el caso de sWCu, las partículas de W mostraron ser redondeadas, formando estructuras que se asemejan a agregados, y más pequeñas que las partículas de Cu, que mostraron formas más angulares (Fig. 1A, E).

Además, se evaluó la presencia de los elementos que componen los polvos seleccionados en lixiviados obtenidos después de incubar los materiales en agua, a una concentración de 10 g/L, durante 3 meses. Los niveles de W y Cu se analizaron en las muestras sWCu y ncWCu. La aleación nc mostró liberar mayores concentraciones de ambos elementos (W: 323.669,15 ppb; Cu: 45.110,10 ppb) en comparación con la muestra de tamaño de grano estándar (W: 119.101,26 ppb; Cu: 4096,84 ppb). En el caso de los lixiviados de WAl nc, se detectaron niveles de W inferiores a los observados en ambas muestras de WCu (24.829 ppb), mientras que la concentración de Al detectada fue baja (136,31 ppb). Finalmente, la aleación TiAl mostró menor probabilidad de lixiviarse en agua, ya que los niveles de Ti y Al detectados fueron muy bajos (Al: 11,27 ppb; Ti: 0,23 ppb) en comparación con los medidos para sus correspondientes elementos en las otras aleaciones.

En resumen, los análisis de caracterización físico-química revelaron que las tres aleaciones nc estudiadas tienen valores de tamaño de grano similares, estando todas ellas formadas por partículas en la escala micrométrica, con lixiviabilidad variable.

La línea celular A549 se utilizó como modelo de exposición humana para estudiar los posibles efectos peligrosos de las aleaciones nc. Así, se evaluó la viabilidad de esta línea celular tras ser expuesta a diferentes concentraciones de los polvos metálicos, así como la capacidad de estos materiales para desencadenar estrés oxidativo. Los resultados obtenidos en la prueba de viabilidad, que se analizó realizando el ensayo de captación de rojo neutro, se presentan en la Fig. 2A. Se observó una disminución estadísticamente significativa en el porcentaje de células viables después de su exposición a 160 y 800 mg/L de polvos de ncWCu durante 24 h, mostrando valores de viabilidad de ≈ 70% y ≈ 20% respectivamente. En el caso de la muestra de tamaño de grano estándar, solo se observó una disminución significativa en este parámetro cuando las células fueron expuestas a 800 mg/L (≈ 20%). Con respecto a las células A549 expuestas a polvos de aleación de WAl y TiAl nc, no se observó ningún efecto negativo en su viabilidad, lo que indica que ambos materiales son seguros para este organismo modelo en las condiciones probadas.

Impacto de la exposición directa de células A549 a diferentes concentraciones de polvos metálicos. (A) Viabilidad de las células A549 (ensayo de rojo neutro). Los resultados se expresan como % del control (células no tratadas). (B) Estrés oxidativo (niveles de ROS) en células A549. Los resultados se expresan como el valor de fluorescencia relativo al control (células no tratadas) al que se le asignó un valor de 1. Los datos representan la media ± desviación estándar, DE. Las diferencias se establecieron mediante un ANOVA unidireccional seguido de una prueba post hoc de Dunnett para comparar cada media con el control, y se consideraron significativas en P ≤ 0,05. *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001, ****P ≤ 0,0001.

La capacidad de los materiales seleccionados para inducir estrés oxidativo también se evaluó en la línea celular A549 utilizando el DCFH-DA como indicador de producción de ROS (Fig. 2B). Los resultados obtenidos muestran la producción de estrés oxidativo en células A549 después de 1 h de exposición a polvos de ncWCu, siendo los niveles de ROS observados estadísticamente significativos en las dos concentraciones más altas probadas (160 y 800 mg/L). Sin embargo, las células expuestas a sWCu mostraron niveles estadísticamente significativos de estrés oxidativo solo cuando se incubaron en presencia de 800 mg/L, teniendo niveles de ROS aproximadamente dos veces más bajos que los inducidos por ncWCu. Por su parte, los polvos de WAl también aumentaron significativamente los niveles de ROS de las células A549, de forma claramente dependiente de la dosis, a partir de 32 mg/L. Por el contrario, los polvos de TiAl no mostraron capacidad para inducir estrés oxidativo en células A549, en las condiciones probadas.

El potencial toxicológico de los productos lixiviados obtenidos luego de la incubación de los polvos metálicos durante 3 meses en agua también fue evaluado mediante los mismos ensayos empleados para realizar las pruebas de contacto directo. Como se muestra en la Fig. 3A, solo las concentraciones de lixiviados equivalentes a 800 mg/L de ambas muestras de WCu disminuyeron la viabilidad de las células A549. Este efecto fue mayor en el caso de las células expuestas a lixiviados de ncWCu, que mostraron una reducción de ≈ 30% en su viabilidad, mientras que los lixiviados de sWCu provocaron una disminución de \(\approx\) 10%. Los lixiviados de aleaciones de WAl y TiAl demostraron ser seguros en todas las condiciones probadas. Con respecto a su capacidad para inducir estrés oxidativo (Fig. 3B), ambos lixiviados de WCu demostraron inducir niveles de ROS estadísticamente significativos en concentraciones equivalentes a 160 y 800 mg/L. En el caso de los lixiviados de WAl, sólo se observaron niveles significativos de estrés oxidativo en concentraciones equivalentes a 800 mg/L. Finalmente, como se observó en las determinaciones de contacto directo para TiAl, los lixiviados de este material no indujeron estrés oxidativo en ninguna de las concentraciones probadas.

Efectos en células A549 luego de ser expuestas a diferentes concentraciones de lixiviados en polvo. (A) Viabilidad de las células A549 (ensayo de rojo neutro). Los resultados se expresan como % del control (células no tratadas). (B) Estrés oxidativo (niveles de ROS) en células A549. Los resultados se expresan como el valor de fluorescencia relativo al control (células no tratadas) al que se le asignó un valor de 1. Los datos representan la media ± desviación estándar, DE. Las diferencias se establecieron mediante un ANOVA unidireccional seguido de una prueba post hoc de Dunnett para comparar cada media con el control, y se consideraron significativas en P ≤ 0,05. **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001, ****P ≤ 0,0001.

El uso generalizado de aleaciones metálicas en diversos campos ha hecho necesaria su evaluación toxicológica, donde se han empleado diferentes líneas celulares como organismo modelo. Por ejemplo, la biocompatibilidad de las aleaciones de Ti aplicadas en la fabricación de dispositivos médicos, como implantes dentales u ortopédicos, se ha estudiado ampliamente utilizando distintas líneas celulares humanas obtenidas de diferentes tejidos27. Del mismo modo, la toxicidad de las aleaciones W, con un uso cada vez mayor en aplicaciones militares en sustitución del plomo en la fabricación de municiones, ha sido objeto de estudio mediante el uso de diversas líneas celulares28. Además de la composición, el tamaño y la forma son factores importantes que afectan críticamente la toxicidad inherente de una aleación. Por ejemplo, en el caso del Ti, los resultados experimentales mostraron que el polvo elemental de este metal puede ser sustancialmente citotóxico, mientras que el Ti en masa es biocompatible23. Los autores explicaron las diferencias observadas argumentando que la concentración de iones liberados en el medio por los metales elementales a granel es significativamente menor que la liberada por el polvo, por lo que son menos citotóxicos. En el presente trabajo, las aleaciones seleccionadas sometidas a estudio se encontraban en forma de polvo, presentando partículas en la escala micrométrica. Considerando su capacidad para reducir la viabilidad celular y causar estrés oxidativo, los resultados mostraron que ncWCu es la aleación más citotóxica, mientras que TiAl es la más segura en las condiciones estudiadas. Los resultados obtenidos también indicaron una correspondencia entre la susceptibilidad de los materiales a la lixiviación y su toxicidad asociada: ncWCu fue la aleación que liberó los niveles más altos de sus componentes en los lixiviados, mientras que TiAl lixivió niveles muy bajos de Ti y Al. Además, los niveles más bajos de Cu y W detectados en el lixiviado de sWCu, en comparación con los detectados en su homólogo aleado (la concentración de W y Cu fue ≈ 3 y ≈ 11 veces mayor en los lixiviados de ncWCu que en los lixiviados de sWCu, respectivamente), también podrían Explique sus diferencias en toxicidad sobre las células A549. En este sentido, Palombella et al. analizó el potencial citotóxico de micro y nanopartículas de hierro, cobalto y níquel de valencia cero en células madre del tejido adiposo humano, sugiriendo que los efectos perniciosos que producían las micropartículas podrían ser causados por la liberación de iones en el medio circundante, o por la presencia de estas partículas alrededor de las células, lo que conduciría a una reducción en la eficiencia del intercambio de oxígeno y nutrientes29.

Considerando que todos los lixiviados analizados en este trabajo, excepto los de TiAl (que tienen concentraciones muy bajas de Ti y Al), pueden causar estrés oxidativo e incluso muerte celular (en el caso de ambas muestras de WCu), se puede sugerir que los iones liberados juegan un papel importante en la toxicidad de los materiales estudiados. Además, dado que la intensidad de la respuesta citotóxica fue mayor en los experimentos de contacto directo, se puede suponer que los efectos observados se producen por una combinación de los iones liberados junto con la interacción directa de las células con las partículas metálicas. En este sentido, se puede destacar que algunas partículas de aleaciones metálicas han sido descritas como causantes de estrés oxidativo sin necesidad de liberar niveles peligrosos de iones al medio30,31.

El potencial toxicológico de las aleaciones de NC con diferente composición también se determinó para la levadura Saccharomyces cerevisiae, un hongo unicelular susceptible ampliamente utilizado como modelo para comprender los mecanismos moleculares en células eucariotas32, y también en estudios de ecotoxicología33. La viabilidad de las células de levadura después de la exposición a dos concentraciones de materiales diferentes (800 y 8000 mg/L) y tiempos (2 y 24 h) se analizó mediante la determinación de unidades formadoras de colonias (UFC) (Fig. 4).

Unidades formadoras de colonias (UFC) de células de S. cerevisiae expuestas a diferentes polvos metálicos en dos tiempos de exposición (2 y 24 h) y dos concentraciones (800 y 8000 mg/L). Los resultados se expresan como el porcentaje (%) de UFC determinado para cada condición de exposición utilizando como valor de referencia la condición de células no expuestas, a la que se le asignó un valor de 100%. Los datos representan la media ± desviación estándar, DE. Las diferencias se establecieron mediante un ANOVA unidireccional seguido de una prueba post hoc de Dunnett para comparar cada media con el control, y se consideraron significativas en P ≤ 0,05. *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01.

Con un tiempo de exposición corto (2 h), no se pudieron observar diferencias significativas en la viabilidad de S. cerevisiae entre la condición de control (células no expuestas) y cualquiera de las 4 muestras analizadas en ambas concentraciones. Sin embargo, cuando se aumentó el tiempo de exposición (24 h), se pudieron observar algunas diferencias de viabilidad entre las condiciones estudiadas. En particular, se observó una disminución significativa en la viabilidad de las células de S. cerevisiae en presencia de una mayor concentración de aleaciones WAl y TiAl (P ≤ 0,01 y P ≤ 0,05 respectivamente) durante 24 h.

Se determinó el potencial toxicológico de las aleaciones presentes en suspensiones líquidas y se investigó su capacidad para inducir la formación de ROS. Nuevamente, se usaron 800 y 8000 mg/L de diferentes polvos metálicos para exponer células de S. cerevisiae, durante 2 h.

Como se muestra en la Fig. 5, las diferencias en los niveles relativos de fluorescencia observados entre las células de S. cerevisiae expuestas a las distintas aleaciones fueron menores. En la concentración más alta, los niveles promedio más altos de ROS se observaron para las aleaciones WCu y TiAl, pero no fueron significativamente diferentes de los observados para el resto de las condiciones probadas, incluida la condición de control.

Análisis de inducción de ROS de células de S. cerevisiae expuestas a diferentes polvos metálicos durante 2 h a dos concentraciones diferentes (800 y 8000 mg/L). Los resultados se expresan como valores de fluorescencia arbitrarios. Los datos representan la media ± desviación estándar, DE. Las diferencias se establecieron mediante un ANOVA unidireccional seguido de una prueba post hoc de Dunnett para comparar cada media con el control, y se consideraron significativas en P ≤ 0,05.

Si bien el efecto de los metales y metaloides sobre S. cerevisiae ha sido un tema de estudio para muchos investigadores, generando conocimiento en diferentes aspectos de la biología de los metales34, se sabe poco sobre el efecto de combinaciones específicas de metales sobre hongos y otros microorganismos. Los resultados obtenidos indican que la capacidad de inducir daño celular por las diferentes aleaciones en células de S. cerevisiae, incluso en presencia de concentraciones muy altas, es muy baja. Esto indica que los factores que rigen la toxicidad de los metales en S. cerevisiae, como la concentración, la especiación y el estado de oxidación, son de menor preocupación en el caso de las aleaciones analizadas. Por lo tanto, debido a la baja toxicidad observada, decidimos no realizar análisis adicionales utilizando soluciones de lixiviados de aleaciones.

Se evaluó el impacto de las aleaciones nc en la bacteria marina V. fischeri monitoreando la bioluminiscencia producida por este microorganismo en presencia de lixiviados equivalentes a 160 y 800 mg/L de los diferentes materiales. La Figura 6 representa la evolución de la intensidad de la luz producida por las bacterias monitoreadas durante un período de 30 min con intervalos de 5 min. Las curvas mostraron que todos los lixiviados provocaron una caída de ≈ 50% en el pico de bioluminiscencia inicial, similar a la caída observada en el control de inhibición (ZnSO4·7H2O). A partir de este momento, la bioluminiscencia se mantuvo constante en las suspensiones bacterianas expuestas a lixiviados de WAl y TiAl, siendo la intensidad de la luz comparable a la mostrada por el control (células no expuestas) para ambas concentraciones ensayadas después de 20 min de exposición. En el caso de las bacterias incubadas con lixiviados equivalentes a 160 mg/L de sWCu, la evolución de la intensidad luminosa fue similar a la descrita para los lixiviados de TiAl y WAl, mientras que se observó una disminución en la bioluminiscencia a una concentración equivalente a 800 mg/L. L después de 30 min de incubación (≈ 40% menos luminiscencia que en el control). Los lixiviados de ncWCu demostraron tener un impacto crítico en V. fischeri, ya que las dos concentraciones utilizadas para realizar el experimento provocaron una caída en la intensidad de la luz similar a la observada en el control de inhibición (ZnSO4·7H2O), provocando una pérdida completa de bioluminiscencia.

Impacto de los diferentes lixiviados de polvo metálico en la bioluminiscencia de V. fischeri durante una exposición de 30 min.

Por su sencillez y rápida respuesta, junto con la confiabilidad y sensibilidad de las pruebas donde se aplica, la bacteria marina V. fischeri es un organismo útil para estudiar la toxicidad de diferentes compuestos35. Por ejemplo, este organismo bioluminiscente se ha aplicado para evaluar el peligro potencial de diferentes metales pesados y mezclas de ellos36, así como en combinación con otras sustancias, como hidrocarburos aromáticos policíclicos o ácidos húmicos37,38. En relación con la exposición de bacterias marinas a diferentes lixiviados metálicos, nuestros resultados han demostrado que los derivados de ncWCu, que contienen concentraciones muy altas de Cu y W, redujeron drásticamente su intensidad luminosa en ambas concentraciones probadas. Anteriormente, se informó que 0,8 mg/L de Cu eran capaces de inducir una inhibición casi completa de la luz emitida por V. fischeri después de 2 h de exposición37. Por lo tanto, la altísima concentración de este elemento detectada en el lixiviado de ncWCu fue probablemente la principal causa de los efectos observados. Si bien Cu y W también se encontraron en los lixiviados obtenidos de polvos de sWCu, las concentraciones de ambos elementos fueron mucho menores, por lo que la disminución en la luminiscencia de V. fischeri solo se observó en la exposición a la concentración más alta probada.

El impacto potencial que un material recientemente desarrollado puede representar para la salud humana y el medio ambiente es una cuestión que debe considerarse adecuadamente durante su etapa de desarrollo. En el presente estudio, se evaluaron desde una perspectiva toxicológica tres aleaciones binarias nanocristalinas consideradas candidatas prometedoras para su uso en la industria aeroespacial, debido a sus desafiantes propiedades en condiciones extremas y su viabilidad de fabricación. Así, se analizaron polvos metálicos de aleaciones WCu, WAl y TiAl nc y sus lixiviados asociados en diferentes organismos modelo. Además, en los ensayos se incluyó una muestra de polvo que contenía una mezcla de W-Cu de tamaño de grano estándar. En términos generales, TiAl destacó como la aleación más segura, ya que sólo grandes concentraciones de los polvos resultaron en efectos negativos para las células de levadura, mientras que ni los lixiviados, ni los polvos, produjeron efectos nocivos en el resto de los organismos probados, en ninguno de los casos. las concentraciones evaluadas.

Parece existir una relación entre la toxicidad de las aleaciones y su susceptibilidad a lixiviar elementos al medio acuoso. Mientras que se lixiviaron niveles muy bajos de Ti y Al de la aleación TiAl nc, que resultó ser el material más seguro de los probados en el presente estudio, el ncWCu mostró una gran susceptibilidad a la lixiviación, siendo además el más tóxico para las células A549 y V. fischeri en las condiciones probadas. Sorprendentemente, esta aleación demostró ser inofensiva para la levadura, donde incluso en grandes concentraciones no provocó una disminución de su viabilidad ni estrés oxidativo. En conjunto, los resultados presentados proporcionan una evaluación toxicológica preliminar de diferentes aleaciones de nc, lo que indica que, desde el punto de vista de la seguridad, nc TiAl podría ser una buena aleación candidata para su desarrollo e introducción en la industria.

La síntesis de los polvos de aleaciones nanocristalinas utilizados en este trabajo para realizar ensayos de toxicidad se realizó en las plantas industriales de nanomateriales MBN mediante Molino de Bolas de Alta Energía, aplicando una tecnología patentada de proceso de síntesis mecanoquímico (Mechanomade®). Se utilizó polvo metálico de calidad industrial de W, Al, Cu y Ti en la proporción adecuada para obtener la composición deseada. Los sistemas W50Cu50, Ti75Al25 y W80Al20 fueron producidos y denominados en este trabajo como ncWCu, TiAl y WAl respectivamente. Para evitar al máximo la oxidación del polvo, el proceso de aleación mecánica se realizó en atmósfera inerte de Ar, que también se mantuvo durante el tamizado realizado para eliminar partículas de mayor tamaño y durante el envasado. Para disminuir la contaminación, los materiales de la cámara de molienda y de las bolas de molienda han sido diferentes para cada aleación binaria y para cada equipo de molienda. En particular, los materiales finales utilizados fueron los siguientes:

Sistema W-Cu: Bolas de bronce y acero duro para la cámara de molienda.

Sistema W-Al: Acero duro para la cámara de molienda y la bola.

Sistema Ti–Al: Titanio Grado 5 para las bolas y acero duro para la cámara de molienda.

En los experimentos también se utilizó una mezcla de polvos de tungsteno y cobre de calidad comercial (25% en peso de Cu) con tamaño de grano estándar. Esta muestra fue nombrada en este trabajo como sWCu.

La microestructura de las muestras de polvo aleado mecánicamente se caracterizó mediante un difractómetro XRD SIEMENS 5005, utilizando blanco de cobalto, en las instalaciones de nanomateriales de MBN.

La composición de la superficie de los polvos metálicos utilizados en los ensayos de toxicidad se caracterizó semicuantitativamente aplicando SEM-EDX. En las instalaciones de la Universidad de Burgos se utilizó un microscopio JEOL JSM-6460LV equipado con un detector de energía dispersiva X-MaxN para realizar la identificación de elementos y cuantificación de los polvos metálicos. Se seleccionaron aleatoriamente al menos 3 áreas diferentes para realizar el análisis de cada material.

La morfología y el tamaño de las partículas fueron visualizados y analizados mediante Microscopía Electrónica de Barrido. Para ello, se examinó directamente una pequeña cantidad de cada muestra utilizando JEOL JSM-6460LV en la Universidad de Burgos.

Se prepararon suspensiones acuosas de polvos molidos (10 g/L), para ser utilizados en los experimentos de contacto directo en diferentes concentraciones. Antes de cada experimento, las reservas de polvos metálicos se homogeneizaron agitando las muestras a máxima velocidad durante 1 minuto, sometiéndolas a ultrasonidos a baja intensidad de potencia y finalmente aplicando un paso de vórtice adicional.

Los lixiviados se obtuvieron almacenando suspensiones de polvos metálicos (10 g/L) a 4 °C durante 3 meses. Posteriormente, las muestras se centrifugaron y los sobrenadantes se recuperaron y filtraron a través de membranas de polietersulfona 0,22.

Los elementos presentes en las muestras de lixiviados, obtenidos tras la filtración con filtros de membrana de polietersulfona de 0,2 µm de la fracción acuosa recuperada de suspensiones de polvos metálicos (10 g/L) incubadas durante 3 meses, fueron estudiados mediante espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). ) utilizando un instrumento Agilent 8900 ICP-QQQ en la Universidad de Burgos.

La línea celular de cáncer de pulmón A549 se cultivó en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) comercial suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% (v/v) y penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 mg/l. Las células se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5%.

La cepa BY4741 de S. cerevisiae se cultivó y mantuvo en medio YPD estándar (1 % de extracto de levadura, 1 % de bactopeptona de levadura, 2 % de glucosa). Los cultivos celulares en medio líquido se incubaron en un agitador giratorio a 185 rpm a 30 °C.

La bacteria bioluminiscente Gram negativa V. fischeri NRRL B-11177 se mantuvo a temperatura ambiente en Marine Broth o Agar 2216.

La viabilidad de las células A549 expuestas directamente a polvos de aleación nc se evaluó aplicando el ensayo de Rojo Neutro. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos con una densidad de 3 x 104 células por pocillo y se incubaron 24 h, después de lo cual las células se expusieron a diferentes concentraciones de los materiales (6,4, 32, 160 y 800 mg/l) resuspendidos en medio de tratamiento fresco ( DMEM con 1% FBS y sin antibiótico). Las células incubadas solo con medio de tratamiento se incluyeron en los experimentos como control de células vivas. Después de la exposición, los pocillos se lavaron con DPBS y se añadieron a cada pocillo 100 µl de una solución de rojo neutro (40 µg/ml) durante 2,5 h. Posteriormente se descartó esta solución, las células se lavaron una vez con DPBS y se fijaron durante 2 minutos con formaldehído al 4%. Las células se lavaron nuevamente con DPBS y se agregaron a cada pocillo 150 µl de una solución liberadora de colorante que contenía 50% de etanol a 96°, 49% de H2O destilada y 1% de ácido acético. Finalmente, las placas se agitaron durante 10 minutos y se transfirieron 100 µl de cada pocillo a una placa opaca de 96 pocillos para medir la fluorescencia utilizando un lector de microplacas (BioTek Synergy HT, longitud de onda de excitación, 530/25; longitud de onda de emisión 645/40). . Los resultados se expresaron como porcentaje del control (fluorescencia de las células en ausencia de aleaciones nc). Se realizaron dos experimentos independientes, con 3 réplicas biológicas por condición de exposición en cada caso. Para probar la toxicidad de los lixiviados, las células se expusieron a diferentes concentraciones (lixiviados equivalentes a 6,4, 32, 160 y 800 mg/L de las aleaciones) durante 24 h, y se estudió la viabilidad celular aplicando el protocolo anteriormente explicado.

Las células A549 sembradas en placas de 96 pocillos a 3 x 104 células por pocillo se lavaron con solución salina equilibrada de Hank (HBSS) sin rojo fenol y posteriormente se incubaron con una solución de DCFH-DA (diacetato de 2ʹ,7ʹ-diclorofluorescina) en HBSS (50 µM) durante 30 min a 37 °C en la oscuridad. Después de este tiempo, las células se lavaron nuevamente con HBSS y luego se expusieron a diferentes concentraciones de polvos de aleación nc (6,4, 32, 160 y 800 mg/L) resuspendidos en HBSS, utilizando como control células incubadas solo con HBSS. Finalmente, se midió la fluorescencia después de 60 minutos de incubación utilizando un lector de microplacas (BioTek Synergy HT, longitud de onda de excitación, 485/20; longitud de onda de emisión 528/20). Se realizaron dos experimentos independientes, con 3 réplicas biológicas por condición de exposición en cada caso. Se analizó aplicando el mismo protocolo el estrés oxidativo inducido por lixiviados equivalentes a las mismas concentraciones de las aleaciones nc utilizadas en los experimentos de contacto directo.

Se precultivaron células de S. cerevisiae en medio YPD en un agitador orbital (30 ºC y 185 rpm) hasta alcanzar una DO600 nm = 1, y luego se expusieron a 800 u 8000 mg/L de los diferentes polvos metálicos en el mismo medio de cultivo, o cultivo no expuesto (control negativo), en placas de 24 pocillos (volumen final de 1 mL). Posteriormente se obtuvieron muestras de cultivo a las 2 y 24 h de exposición. Para determinar las UFC en ambos tiempos de muestreo, se diluyeron 100 µL de células 104 veces, en el caso de una exposición de 2 h, y 105 veces, en el caso de una exposición de 24 h, se inocularon en placas de medio sólido YPD (agar al 6%) y se incubaron a 30 ºC durante 48 h.

El colorante CM-H2DCFDA se utilizó para cuantificar los niveles de ROS intracelulares en levaduras, empleando un protocolo similar al descrito previamente por James et al.39, recientemente adaptado por nuestro grupo de investigación40. Brevemente, se sedimentaron, lavaron e incubaron células de S. cerevisiae que crecían en fase exponencial con CM-H2DCFDA (7 µM) en DPBS durante 60 minutos a 30 °C y 185 rpm. Posteriormente, las células se lavaron nuevamente, se resuspendieron en YPD y se expusieron a las diferentes muestras (800 y 8000 mg/L) durante 2 h. Luego, las células de levadura se lavaron dos veces con DPBS, se incubaron 2 min en una solución que contenía acetato de litio 2 M, se lavaron y se incubaron nuevamente durante 2 min en una solución que contenía SDS (0,01%) y cloroformo (0,4%). Finalmente se sedimentaron las células y el sobrenadante se transfirió a una placa de micropocillos opaca negra de 96, donde se midió la fluorescencia (longitud de onda de excitación, 485/20; longitud de onda de emisión 528/20) utilizando un lector de microplacas (Synergy-HT, BioTek).

Se estudió el impacto de los lixiviados en polvo, equivalentes a 160 y 800 mg/L, sobre la luminiscencia producida por V. fischeri aplicando el ensayo de inhibición de la bioluminiscencia. Brevemente, se incubó un cultivo de 5 ml de Marine Broth 2216 inoculado con una colonia luminiscente durante 48 h a 15 °C. Luego se centrifugó la suspensión bacteriana y el sedimento se resuspendió en 5 ml de NaCl al 2% (p/v) y se preincubó a 10 °C durante 30 minutos antes del inicio del experimento. Se añadieron a cada pocillo en microplacas opacas de 96 pocillos 90 µl de lixiviados resuspendidos en una solución de NaCl al 2 % en las concentraciones especificadas anteriormente. Las bacterias no expuestas, resuspendidas en NaCl al 2%, se incluyeron en el ensayo como control, para monitorear la atenuación de la luz natural de este microorganismo, mientras que las células bacterianas incubadas con ZnSO4·7H2O a 219,8 mg/L se incluyeron como control de inhibición de la luz. Para llevar a cabo el experimento, se agregaron 10 µL de la suspensión bacteriana a cada pocillo y la placa se incubó en un Thermomixer (800 rpm, 15 °C). La luminiscencia de cada muestra se registró en intervalos de 5 min a lo largo de 30 min en un lector de microplacas (Synergy-HT, BioTek), siendo el punto de partida el valor medido inmediatamente después de la adición de las bacterias.

Los datos se presentan como medias ± DE. Se utilizó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Dunnett para establecer comparaciones entre cada media y el control. Las pruebas estadísticas se realizaron utilizando Prism 6.0 (GraphPad Prism, GraphPad Software, Inc.), considerando las diferencias significativas a P ≤ 0,05.

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Este trabajo recibió financiación de los proyectos Horizonte 2020 de la UE ICARUS (H2020-FETOPEN-2014-2015-RIA, acuerdo de subvención N° 713514) e ICARUS-INAS (FETOPEN-03-2018-2019-2020, acuerdo de subvención N° 946174). Agradecemos a la Dra. Gréta Gergely y Dániel Pethõ, de la Universidad de Miskolc, por brindarnos amablemente los polvos WCu y por su invaluable ayuda.

International Research Center in Critical Raw Materials-ICCRAM, Universidad de Burgos, Plaza Misael Bañuelos s/n, 09001, Burgos, Spain

Carlos Rumbo, Rocío Barros, Sonia Martel Martín & Juan Antonio Tamayo-Ramos

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Alvise Bianchin

Departamento de Ingeniería Mecánica, Química y de Materiales, Universidad de Cagliari, via Marengo 2, 09123, Cagliari, Italia

Antonio Mario Locci

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CR y JATR conceptualizaron el estudio. CR y JATR realizaron los experimentos. CR, JATR, AB, AML, RB y SMM analizaron e interpretaron los datos. CR escribió el borrador original. JATR, AB y AML participaron en la redacción. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Carlos Rumbo o Juan Antonio Tamayo-Ramos.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Rumbo, C., Bianchin, A., Locci, AM et al. Evaluación toxicológica de aleaciones metálicas nanocristalinas con potenciales aplicaciones en el campo aeronáutico. Informe científico 12, 1523 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-05406-5

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Recibido: 29 de octubre de 2021

Aceptado: 11 de enero de 2022

Publicado: 27 de enero de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-05406-5

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